大战绿妖后,性情温和的彼得·帕克(托比·马奎尔饰)强忍心痛拒绝了他今生惟一的至爱玛丽·简(克斯汀·邓斯特饰),决定用自己瘦弱的双臂肩负起作为"蜘蛛侠"的责任。
两年来,彼得一直忙于应付接踵而来的新挑战:首先,他要学会将超能力使用得收放自如;其次,还得小心翼翼地维持着自己的双重身份,在超级英雄蜘蛛侠和平凡大学生的生活中努力保持平衡。但是双面人的生活十分痛苦,他对玛丽·简的爱火愈燃愈烈,可蜘蛛侠的身份又让他不得不隐匿真情。与此同时,玛丽就像每一个普通人一样有条不紊地继续着自己的生活:她已经实现了自己的演员梦,而且,她的生命中又出现了另一个值得爱的男人--彼得开始认真考虑是否应该放弃秘密身份去大胆表达自己的爱。
另外,彼得的好友哈里·奥斯本(詹姆斯·弗兰克饰)在杀父之仇的驱使下,处处与蜘蛛侠为敌,两个人的关系也因此时刻笼罩在不安中;连一向对他爱护有加的婶婶(罗丝玛丽·哈里斯饰)也开始怀疑他的真实身份。就在彼得疲于奔命的时候,他又遇到了一个强劲的对手--章鱼博士(阿尔弗雷德·莫利纳饰),于是彼得学会了命运的意义在于接受而不是逃避,他必须拼尽全力去阻止这个疯子的邪恶计划……